Forskare använder olika molekylärbiologiska tekniker för att analysera DNA. I den här artikeln har jag sammanfattat några av dem åt dig så att du bättre kan förstå de allmänna principerna och stegen som är involverade i deras funktion.
Restriktionsenzymer och molekylär kloning
Många kopior av en gen av intresse kan göras genom att isolera genen, placera den i bakterier och sedan odla bakterierna. När bakterierna växer kommer den också att replikera genen av intresse. Genen av intresse eller dess proteinprodukt kan sedan isoleras. Ett restriktionsenzym används för att skära genen av intresse från DNA. Därefter skärs en bakterieplasmid som innehåller en biomarkör med samma restriktionsenzym. Snittet i både moder-DNA och plasmiden har överhäng eller “klibbiga ändar” som kompletterar varandra. I nästa steg ligeras de samman för att bilda en rekombinant plasmid. Denna plasmid placeras sedan i bakterier genom en process som kallas transformation. När bakterierna växer replikeras genen av intresse och kan senare isoleras.
Molekylär kloning med PCR
I de fall där en liten mängd DNA är tillgänglig är det bättre att använda PCR för kloning. Denna metod kräver inga restriktionsenzymer. Processen involverar snabb amplifiering av genen av intresse i de första stegen, följt av ligering in i en vektor (plasmid) enligt ovan. Vektorn kan sedan placeras i bakterier och sedan odlas för att replikera genen av intresse.
DNA-bibliotek
Ett DNA-bibliotek är en samling DNA-fragment som representerar hela genomet av en organism. DNA:t lagras i en population av identiska vektorer, var och en med ett fragment av DNA:t. Det konstrueras genom att först extrahera DNA:t och sedan smälta det med restriktionsenzymer för att göra många fragment. Fragmenten infogas sedan i en vektor (plasmid) och överförs sedan till en värd såsom E. coli för amplifiering. Med hjälp av detta bibliotek kan forskare isolera och studera specifika kolonier som har de gener som de är intresserade av att studera.
Southern Blotting
Southern blotting är en teknik som används för att detektera en specifik sekvens av DNA i en komplex blandning. Processen börjar med att skära upp DNA:t i fragment med hjälp av restriktionsenzymer och sedan separera fragmenten efter storlek med hjälp av gelelektrofores. En mild alkali (NaOH) används sedan för att denaturera DNA:t och transformera det från dubbelsträngat till enkelsträngat. DNA:t överförs sedan till ett nylon- eller nitrocellulosamembran, varefter en sond tillsätts. Eftersom proberna är komplementära till genen av intresse kommer endast dessa gener att hybridiseras. De hybridiserade generna kan sedan visualiseras med hjälp av autoradiografi, fluorescens eller färgförändring, beroende på vilken typ av sond som används.
Northern Blotting
Northern blotting bestämmer närvaron av RNA, vilket i slutändan talar om om en gen uttrycks. Det första steget är att extrahera RNA:t och denaturera det med formaldehyd för att ta bort basparning (kom ihåg att RNA, även om det är enkelsträngat, kan baspar med sig självt). RNA:t separeras sedan genom gelelektrofores, överförs till ett membran och behandlas sedan med en radioaktiv sond. Sonden binder till RNA av intresse och kan visualiseras med hjälp av en autoradiografisk metod.
Sanger Sequencing
Sangersekvens är en metod som används för att bestämma bokstavssekvensen i DNA. Under processen inkorporeras både deoxinukleotider (dNTP) och dideoxinukleotider (ddNTP) av DNA-polymeras i det DNA som ska kopieras. Eftersom ddNTP saknar en hydroxylgrupp vid 3′-änden sker avslutning när de tillsätts. Detta skapar fraktioner av olika storlekar, där den sista nukleotiden på varje fragment representerar en ddNTP. Fraktionerna kan sedan separeras med hjälp av elektrofores. Eftersom den sista bokstaven i varje fragment är känd, kan den korrekta sekvensen bestämmas genom att läsa gelén från botten till toppen (minsta fragmentet till det största). Här är de viktigaste stegen i processen –
- Amplifiera DNA:t med PCR
- Tillsätt amplifierat DNA i ett reaktionskärl innehållande
- Primer
- DNA-polymeras
- De fyra normala nukleotiderna (A, T, G och C)
- Små koncentrationer av de fyra sondkopplade modifierade nukleotiderna (ddATP, ddTTP, ddGTP och ddCTP)
- Låt DNA-polymeras kopiera DNA i reaktionskärlet
- Separera de resulterande fragmenten genom elektrofores
- Skriv ner sekvensen genom att läsa gelén från botten till toppen
Courtney Simons
Administratör
Courtney Simons är professor i matvetenskap. Han har en kandidatexamen i livsmedelsvetenskap och en doktorsexamen. i spannmålsvetenskap från North Dakota State University.